【目的】研究 ClO₂處理對厚皮甜瓜果實采後愈傷的影響為厚皮甜瓜的采後愈傷提供方法和理論依據。

【方法】以‘瑪瑙’厚皮甜瓜為試材，人工模擬損傷後，用25 mg/L的ClO₂浸泡損傷果實 10min

，於常溫黑暗條件下進行愈傷。測定愈傷期間損傷果實的失重率以及損傷接種粉紅單端孢果實的病情指數
，通過甲苯胺藍和間苯三酚—鹽酸染色法觀察聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質素在傷口部位的積累
，並用 IS Capture 圖像軟件對聚酚軟木脂


、聚(ju)酯(zhi)軟(ruan)木(mu)脂(zhi)和(he)木(mu)質(zhi)素(su)積(ji)累(lei)量(liang)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)。測(ce)定(ding)傷(shang)口(kou)表(biao)麵(mian)的(de)色(se)度(du)值(zhi)，分(fen)析(xi)傷(shang)口(kou)處(chu)組(zu)織(zhi)愈(yu)傷(shang)期(qi)間(jian)苯(ben)丙(bing)烷(wan)代(dai)謝(xie)活(huo)性(xing)以(yi)及(ji)過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)和(he)多(duo)酚(fen)氧(yang)化(hua)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)變(bian)化(hua)。

【結果】ClO₂處理顯著降低了損傷果實的失重率和損傷接種果實的病情指數，愈傷第7天時，處理比對照低10.3%。果實在損傷後不同時間段接種粉紅單端孢，經1周培養觀察，處理果實的病情指數顯著低於對照，第7 天時處理果實的病情指數比對照低 56.9%。處理顯著促進了果實傷口處聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質素的積累，處理果實的積累量在愈傷的中後期顯著高於對照，三者比對照分別高25.3%、77.7%和35.5%。愈傷期間，處理果實傷口處的L*值顯著低於對照，b*值顯著高於對照
，在愈傷第5 天時，處理果實的L*值比對照低6.1%，第3天時的b*值比對照高17.8%。處理明顯提高了果實傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性，在愈傷第7天時，處理果實傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性分別高於對照 34.3%
、80.5%和 15.7%。此外，處理果實傷口處的總酚、類黃酮和木質素含量也顯著高於對照，第7天時，分別高於對照14.7%
、16.8%和 15.6%。

【結論】ClO₂處理可有效促進厚皮甜瓜果實的采後愈傷
，ClO₂對愈傷的促進作用與激活傷口處的苯丙烷代謝，提高POD和PPO活性，促進軟木脂和木質素的積累密切相關。

       【研究意義】厚皮甜瓜(Cucumis melonL.) 是(shi)我(wo)國(guo)西(xi)北(bei)地(di)區(qu)特(te)色(se)水(shui)果(guo)，由(you)於(yu)果(guo)實(shi)個(ge)體(ti)較(jiao)大(da)，在(zai)采(cai)收(shou)和(he)采(cai)後(hou)過(guo)程(cheng)中(zhong)易(yi)受(shou)機(ji)械(xie)損(sun)傷(shang)，機(ji)械(xie)損(sun)傷(shang)造(zao)成(cheng)的(de)表(biao)麵(mian)傷(shang)口(kou)為(wei)病(bing)原(yuan)物(wu)的(de)侵(qin)染(ran)提(ti)供(gong)了(le)通(tong)道(dao)
，加(jia)劇(ju)了(le)采(cai)後(hou)腐(fu)爛(lan)的(de)發(fa)生(sheng)。因(yin)此(ci)，有(you)效(xiao)降(jiang)低(di)傷(shang)口(kou)性(xing)病(bing)原(yuan)菌(jun)的(de)侵(qin)染(ran)率(lv)是(shi)采(cai)後(hou)厚(hou)皮(pi)甜(tian)瓜(gua)亟(ji)待(dai)解(jie)決(jue)的(de)問(wen)題(ti)。前(qian)人(ren)研(yan)究(jiu)進(jin)展(zhan)不(bu)同(tong)果(guo)實(shi)表(biao)麵(mian)形(xing)成(cheng)的(de)傷(shang)口(kou)具(ju)有(you)不(bu)同(tong)程(cheng)度(du)的(de)愈(yu)合(he)能(neng)力(li)
，通(tong)過(guo)在(zai)傷(shang)口(kou)部(bu)位(wei)積(ji)累(lei)軟(ruan)木(mu)脂(zhi)和(he)木(mu)質(zhi)素(su)等(deng)具(ju)有(you)保(bao)護(hu)作(zuo)用(yong)的(de)天(tian)然(ran)聚(ju)合(he)物(wu)，從(cong)而(er)抑(yi)製(zhi)傷(shang)口(kou)部(bu)位(wei)水(shui)分(fen)的(de)大(da)量(liang)蒸(zheng)騰(teng)，阻(zu)止(zhi)病(bing)原(yuan)物(wu)經(jing)由(you)傷(shang)口(kou)的(de)侵(qin)入(ru)。近(jin)期(qi)研(yan)究(jiu)發(fa)現(xian)
，某(mou)些(xie)化(hua)學(xue)藥(yao)物(wu)還(hai)具(ju)有(you)促(cu)進(jin)傷(shang)口(kou)愈(yu)合(he)的(de)作(zuo)用(yong)。例(li)如(ru)

，苯(ben)丙(bing)噻(sai)重(zhong)氮(dan)可(ke)以(yi)促(cu)進(jin)采(cai)後(hou)梨(li)果(guo)實(shi)的(de)愈(yu)傷(shang)，脫(tuo)落(luo)酸(suan)能(neng)提(ti)高(gao)采(cai)後(hou)番(fan)茄(qie)和(he)獼(mi)猴(hou)桃(tao)果(guo)實(shi)的(de)愈(yu)傷(shang)能(neng)力(li)。ClO₂可殺滅病原物，對果蔬風味和品質無明顯影響。有報道表明
，ClO₂處理可減輕龍眼和番茄果實的采後病害
，延緩蘋果成熟衰老，減輕采後腐爛。還可一定程度上抑製鮮切哈密瓜的後熟。而 ClO₂在減輕采後病害中的作用與增強果實苯丙烷代謝和提高氧化酶活性密切相關。

【本研究切入點】雖然已有 ClO₂誘導采後果實抗病性的報道
，但該化合物是否影響厚皮甜瓜果實采後愈傷尚未見報道。擬解決的關鍵問題本研究以“瑪瑙”厚皮甜瓜果實為試材
，用 ClO₂處(chu)理(li)人(ren)工(gong)損(sun)傷(shang)的(de)果(guo)實(shi)後(hou)在(zai)常(chang)溫(wen)條(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行(xing)愈(yu)傷(shang)，測(ce)定(ding)愈(yu)傷(shang)期(qi)間(jian)損(sun)傷(shang)果(guo)實(shi)的(de)失(shi)重(zhong)率(lv)以(yi)及(ji)接(jie)種(zhong)果(guo)實(shi)的(de)病(bing)情(qing)指(zhi)數(shu)，觀(guan)察(cha)愈(yu)傷(shang)組(zu)織(zhi)的(de)色(se)度(du)以(yi)及(ji)聚(ju)酚(fen)軟(ruan)木(mu)脂(zhi)、聚酯軟木脂和木質素的積累變化。分析氧化酶和苯丙烷代謝關鍵酶活性及其代謝產物的含量。評價 ClO₂處理對厚皮甜瓜果實采後愈傷能力的影響，為ClO₂處理在厚皮甜瓜的采後應用提供方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

供試‘瑪瑙’甜瓜於2017年7月采自甘肅省民勤縣收成鄉露地大田
，選取八成熟、外觀整齊
、大小一致、無病蟲傷和機械傷的果實，單果套網套後裝入瓦楞紙包裝箱
，於當天運抵本實驗室, 在常溫下 (20~25℃, RH70-80%) 貯藏待用。

粉紅單端孢(Trichothecium roseum) 為甘肅厚皮甜瓜產區最常見的采後病原真菌,由本實驗室提供，於PDA培養基上保存待用。

ClO₂有效濃度120mg/g
，於4℃冰箱保存。

刮皮刀；恒溫培養箱; 超淨工作台；立式壓力蒸汽滅菌鍋; 正置萬能顯微鏡;Ci6x分光光度儀； 台式高速冷凍離心機; 紫外-可見光分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 果實人工損傷及愈傷

參照薑紅等的方法並進行修改。果實先用清水衝洗
，然後用1%的次氯酸鈉浸泡1min 進行表麵消毒，再用無菌水衝洗，晾幹後用刮皮刀在果實的赤道部位分別刮出4條長30mm、寬30 mm
、深2mm 的傷口。在室溫條件下暴露0.5 h後,將損傷的果實浸入25 mg/L的ClO₂浸泡10min,取出晾幹後分別裝入打孔的聚乙烯保鮮袋(25cm×40cm,厚度0.02mm),於常溫
、避光條件下進行愈傷，以清水處理作對照。每處理用果實120個，重複3次。

1.2.2 愈傷效果的評價

1.2.2.1 失重率及病情指數的測定

失重率的測定采用重量法。每處理用果實9個
，重複3次。

病情指數的測定參照薑紅等的方法並修改。在培養了1 周的T.roseum培養皿中加入一定量的無菌水，用塗布器刮下孢子用4層紗布過濾至錐形瓶中，在振蕩器上振蕩15 s
，經過血球計數板計數配置成濃度為 1×10⁶個/mL 的孢子懸浮液。分別在果實損傷後的第0、1、3、5、7天，用塗布器將20μL配好的孢子懸浮液均勻塗於創口表麵，晾幹後裝入打孔的聚乙烯保鮮袋中，常溫培養7天後統計病情指數。每個處理用果實8個，重複3次。病情指數- ∑(高痔物口傷口個數x態減病吸別)×100式中
，發病級別的標準為：4級，創口表麵全部發病
；3級
，創口表麵 3/4 的麵積發病

；2級，創口表麵1/2麵積發病
；1級，創口表麵 1/4 麵積發病；0級

，創口表麵不發病。

1.2.2.2 聚酚軟木脂

、聚酯軟木脂和木質素沉積的觀察

聚酚軟木脂(suberin poly phenolic, SPP) 和聚酯軟木脂(suberin poly aliphatic,SPA)的沉積觀察參照ILulai的方法並修改。用不鏽鋼刀片垂直傷口表麵切成厚0.2~0.3 mm，長和寬各為1 cm左右的薄片。采用如下步驟進行染色：用0.1%小檗堿(0.05%甲苯胺藍)染色45 min後, 先吸去染料, 再用蒸餾水和 75%酒精洗2~3 遍, 最後用 95%酒精洗 1~2遍，即脫去染料，緊接著在0.25%甲苯胺藍(1%中性紅)中放置1~2m in進行複染，最後用蒸餾水和 75%酒精洗去染料
，SPP(SPA)即染為紫藍色。將染好色的薄片置於載玻片上
，在顯微鏡下熒光觀察拍照。每個果實切片4處，重複3次。

木質素的沉積觀察參照ALBA 等的方法並修改。用不鏽鋼刀片垂直傷口表麵切成厚0.2~0.3mm,長和寬各為1cm左右的薄片, 滴加1%間苯三酚染色1.5min後再加1~2滴濃鹽酸，木質素即染為紅色，置於顯微鏡下觀察拍照。每個果實切片4處，重複3次。

愈傷組織的SPP、SPA 和木質化細胞層的厚度根據文獻的方法通過IS Capture 圖像軟件進行測量計算。

1.2.3 愈傷組織色度的測定

在愈傷的0、1、3


、5
、7 d用Ci6x 分光光度儀垂直於愈傷組織表麵進行色度的測定
，依次測定 L*、a*和b*值
，每個處理測 12處愈傷組織。

1.2.4 生化測定取樣

參照BI等的方法。在愈傷的0、1
、3
、5
、7d
，用不鏽鋼刀片垂直傷口表麵下取2~3mm深的傷口組織3g
，用錫箔紙包好後用液氮冷凍
，在-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性測定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)的測定參照 Liu等的方法並修改。取冷凍樣品3g, 於5mL 硼酸-硼砂緩衝液(pH8.8, 含40g/L 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 2 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 和5 mmol·L⁻¹β-巰基乙醇) 中冰浴研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心30 min, 上層酶液即為粗酶液。反應體係包括: 0.1mL 粗酶液, 3mL 硼酸-硼砂緩衝溶液液 (50mmol/L,pH8.8), 0.5mL食物L-苯丙氨酸(20mmol/L), 以蒸餾水為參比, 測定反應體係混合10s 後在290 nm波長處的吸光值作為初始值(OD₀)，將混合液在37℃水浴鍋中保溫1 h後在 290 nm波長處的吸光值作為終止值(OD₁)。以每小時吸光值變化值增加0.01 為一個酶活性單位 (U), 以U/g FW表示。

過氧化物酶(peroxidase,POD) 和多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO) 的測定參照Li的方法。取冷凍樣品3g, 於5mL 乙酸-乙酸鈉緩衝液((pH5.5, 含 1mmol/L 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),4%交聯聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP) 和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)) 中研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心 30min, 收集上層液用即為粗酶液。POD反應體係: 3mL25mmol/L 愈創木酚, 0.1mL 酶提取液, 0.2mLH₂O₂(5mmol/L)。以蒸餾水為參比, 在反應進行到15s時測定混合液在470nm波長處的吸光值2min。以每分鍾吸光值變化值增加1為一個酶活性單位(U)，以U/gFW 表示,重複3次。PPO反應體係:4mL 乙酸-乙酸鈉緩衝液(50mmol/L,pH5.5),lmL 鄰苯二酚溶液(50mmol/L), 0.1mL 酶提取液。以蒸餾水為參比, 在反應進行到15s 時測定混合液在420nm波長處的吸光值2min。以每分鍾吸光值變化值增加1為一個酶活性單位 (U), 以U/mg FW表示。

1.2.6 總酚、類黃酮和木質素的含量測定

總酚和類黃酮的測定參照Pirie 等的方法並作修改。取冷凍樣品3g

，於預冷的4mL HCL-甲醇溶液中冰浴研磨成漿，在4℃避光條件提取20min，期間搖動數次過濾收集上層清液待用。以 1%HCL-甲醇溶液做為參比，分別測定濾液在280nm和325nm波長處的吸光度值作為總酚和類黃酮的含量，分別以OD280·g⁻¹FW 和(  表示。木質素的含量測定參照Yan等的方法進行測定。取冷凍樣品3g，於預冷5mL95%乙醇中研磨成漿，在4℃, 14000×g條件下離心30min, 棄去上清液, 將沉澱物依次用95%乙醇, 乙醇(V):正己烷(V)=1：2衝洗3次，將清洗後的沉澱物在60℃烘箱中幹燥24 h後轉移至離心管中,溶於1mL25%溴化乙酰冰醋酸溶液,70℃恒溫水浴30min後加入1mL NaOH(2mol/L)終止反應。最後加入2mL冰醋酸和0.1mL鹽酸羥胺(7.5mol/L), 在4℃、12000×g條件下離心 30 min, 取上清液0.5mL並用冰醋酸定容至5mL, 在280nm波長處測定吸光值。

1.3 數據統計

上述測定均重複3次。全部數據用Excel 2010計算平均值和標準誤(±SE),用SPSS 19.0進行 Duncan’s 多重差異顯著性分析及相關性分析 (P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 ClO₂處理對愈傷期間果實失重率和病情指數的影響

愈傷期間，處理和對照果實的失重率均逐漸升高，但處理果實的失重率顯著低於對照，第 7 天時,比對照低 10.3%(P<0.05)(圖 1-A)。處理和對照果實的病情指數均隨愈傷時間的延長逐漸下降，處理果實顯著低於對照，第7天時，僅相當於對照的43.1%(P<0.05)

愈傷期間，處理和對照果實傷口處的SPP 和SPA積累量均逐漸增加，處理果實的積累量在愈傷的中後期均顯著高於對照(圖2-A，B)。SPP和SPA的積累差異分別始於第1天和第3天, 第7 天時 SPP 和 SPA 的積累厚度分別比對照高25.3%和        

處理和對照果實傷口處的木質素積累始於愈傷中期。在第7天時，處理果實木質素的積累厚度比對照高 35.5%(P<0.05)(圖 3-C)。SPP
、SPA 和木質素的積累結果表明, 有效促進了厚皮甜瓜果實傷口處的木栓化。

愈傷期間，處理和對照果實傷口處的L*值均先上升後下降
，在愈傷的後期顯著低於對照, 第5天和第7天時,分別比同期對照低6.1%和5.8%(P<0.05)(圖4-A)。處理和對照果實的a*值差異不顯著(結果未顯示)。兩者b*值總體先降後升，在愈傷的前期和中期顯著高於對照。第3天時, 比對照高17.8%(P<0.05)。

處理對傷口處PAL、POD和 PPO活性以及總酚、類黃酮
、木質素含量的影響

愈傷期間，處理和對照果實傷口處的 PAL 活性均逐漸升高，但處理果實的 PAL 活性顯著高於對照, 第7天時, 比對照高34.3%(P<0.05)(圖5-A)。對照果實的POD和PPO 活性隨愈傷時間的延長逐漸升高
，而處理果實的活性則先略有降低後顯著升高，在愈傷的後期顯著高於對照,第7天時, POD 和 PPO 活性分別比對照高80.5%和15.7%(P<0.05)(圖 5-B

，C)。處理果實傷口處的總酚、類黃酮和木質素含量在愈傷期間均呈先降後升的趨勢,在愈傷的後期顯著高於對照。第7天時,分別比對照高14.7%、16.8%和15.6%(P<0.05)(圖5-D, E, F)。PAL
、POD 和 PPO 活性以及總酚、類黃酮和木質素含量的增加結果表明,  激活了厚皮甜瓜果實傷口處的苯丙烷代謝以及氧化酶活性。

3 討論

ClO₂可通過增強苯丙烷代謝和提高氧化酶活性來誘導果實的采後抗病性。本研究發現，ClO₂處(chu)理(li)可(ke)通(tong)過(guo)激(ji)活(huo)采(cai)後(hou)厚(hou)皮(pi)甜(tian)瓜(gua)果(guo)實(shi)傷(shang)口(kou)處(chu)的(de)苯(ben)丙(bing)烷(wan)代(dai)謝(xie)及(ji)氧(yang)化(hua)酶(mei)活(huo)性(xing)，加(jia)速(su)軟(ruan)木(mu)脂(zhi)和(he)木(mu)質(zhi)素(su)在(zai)傷(shang)口(kou)處(chu)的(de)沉(chen)積(ji)

，從(cong)而(er)促(cu)進(jin)了(le)厚(hou)皮(pi)甜(tian)瓜(gua)果(guo)實(shi)的(de)采(cai)後(hou)愈(yu)傷(shang)。

本研究發現
，ClO₂處理可顯著提高厚皮甜瓜果實傷口處的PPO活性。處理果實傷口處L*值高於對照，b*值低於對照的結果表明
，PPO參與了愈傷組織的形成，處理果實傷口處的L*值在0 d 顯著高於對照可能源於 ClO₂的漂白作用。在愈傷中由於細胞內膜被破壞，液泡中的酚類底物會和PPOfashengfanying，yanghuaweikun，kunzaijinyibujuheweiheisehuohesedewuzhi。zhexiejuhewubujinyinqiguoshizuzhihebian，erqiekezhijieyizhibingyuanjunshengchang
，dunhuabingyuanjunfenmidebaowaimei
，gaijieguoyu Wei等人在獼猴桃愈傷期間觀察到的結果一致。

4 結論

ClO₂采後處理可有效降低損傷果實的失重率和損傷接種果實的病情指數，促進了厚皮甜瓜的采後愈傷。ClO₂處理對采後厚皮甜瓜愈傷的促進作用與激活果實苯丙烷代謝
，提高POD和PPO活性，促進SPP
、SPA和木質素在傷口處的積累密切相關。